超分辨率顯微鏡的各種不同技術(shù)對(duì)比 - 分析行業(yè)新聞

對(duì)于傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡，光的衍射讓成像分辨率限制在大約250 nm。如今，超分辨率技術(shù)可以將此提高10倍以上。這種技術(shù)主要通過(guò)三種方法實(shí)現(xiàn)：?jiǎn)畏肿佣ㄎ伙@微鏡，包括光敏定位顯微鏡（PALM）和隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡（STORM）；結(jié)構(gòu)照明顯微鏡（SIM）；以及受激發(fā)射損耗顯微鏡（STED）。 如何選擇超分辨率技術(shù)，這是大家都關(guān)心的。“不幸的是，并沒(méi)有簡(jiǎn)單的原則來(lái)決定使用哪種方法，”英國(guó)牛津大學(xué)的博士后研究員Mathew Stracy說(shuō)。 “每一種都有其自身的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。” 科學(xué)家當(dāng)然也在想辦法，為特定的項(xiàng)目選擇合適的方法。以色列理工學(xué)院的助理教授Yoav Shechtman表示：“在生物成像的背景下，要考慮的關(guān)鍵因素包括：空間和時(shí)間分辨率、對(duì)光損傷的敏感性、標(biāo)記能力、樣本厚度，以及背景熒光或細(xì)胞自體熒光。” 工作原理 各種超分辨率顯微鏡是以不同的方式工作的。以PALM和STORM為例，在特定時(shí)刻，只有一小部分熒光標(biāo)記激發(fā)或光活化，使得它們能夠高精度地獨(dú)立定位。讓所有熒光標(biāo)記都經(jīng)歷這個(gè)過(guò)程，這也就帶來(lái)了一幅完整的超分辨率圖像。2014年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的獲得者之一、馬普生物物理化學(xué)研究所主任Stefan Hell表示：“PALM/STORM系統(tǒng)相對(duì)容易搭建，但比較難以應(yīng)用，因?yàn)闊晒饣鶊F(tuán)必須具有光活化能力。局限之處在于它們需要檢測(cè)細(xì)胞背景下的單個(gè)熒光分子，在可靠性上不及STED。” STED使用激光脈沖來(lái)激發(fā)熒光基團(tuán)，并使用環(huán)形的激光來(lái)淬滅熒光基團(tuán)，只留下中間納米大小的熒光而得到超高分辨率。掃描整個(gè)樣本，可生成一幅圖像。“STED的優(yōu)勢(shì)在于它是一種按鈕技術(shù)，”Hell解釋說(shuō)。“它用起來(lái)就像標(biāo)準(zhǔn)的共聚焦熒光顯微鏡。”它還可以利用一些熒光基團(tuán)對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行成像，比如綠色或黃色的熒光蛋白和羅丹明衍生染料。 參數(shù)對(duì)比 盡管所有超分辨率技術(shù)在分辨率上都超越了傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡，但彼此也各不相同。SIM大約將分辨率提高一倍，達(dá)到100 nm左右。PALM和STORM則可以分辨15 nm的目標(biāo)。據(jù)Hell介紹，STED在活細(xì)胞中可提供30 nm的空間分辨率，在固定細(xì)胞中可達(dá)15 nm。 在涉及到特定應(yīng)用時(shí)，我們還必須考慮信噪比。在有些情況下，分辨率較低但信噪比較高可能會(huì)比相反情況（分辨率較高但信噪比較低）帶來(lái)更好的圖像。 圖像獲取的速度也相當(dāng)重要，特別是對(duì)于活細(xì)胞。“所有的超分辨率技術(shù)都比常規(guī)的熒光成像技術(shù)要慢，”Stracy說(shuō)。“PALM/STORM是*慢的，需要成千上萬(wàn)幀來(lái)獲得單幅圖像，SIM需要幾十幀，而STED是一種掃描技術(shù)，所以采集速度取決于視野的大小。” 除了活細(xì)胞或固定細(xì)胞成像，一些科學(xué)家也想了解對(duì)象如何移動(dòng)。Stracy就很有興趣了解活細(xì)胞中生物系統(tǒng)的動(dòng)力學(xué)，而不僅僅是靜態(tài)圖像。他將PALM與單顆粒追蹤相結(jié)合，來(lái)分析活細(xì)胞中的動(dòng)力學(xué)。通過(guò)這種方式，他可以在標(biāo)記分子行使功能時(shí)直接追蹤它們。不過(guò)，他認(rèn)為SIM并不適合研究這些分子水平的動(dòng)態(tài)過(guò)程，但是由于獲取速度快，它特別適合觀察較大結(jié)構(gòu)的動(dòng)力學(xué)，如整條染色體。 *新成果 2017年，Hell的團(tuán)隊(duì)在《Science》上報(bào)道了MINFLUX超分辨率顯微鏡。據(jù)Hell介紹，這種超分辨率方法**次達(dá)到1 nm的空間分辨率。此外，它還能追蹤活細(xì)胞中的單個(gè)分子，速度比其他方法至少快100倍。 其他科學(xué)家也高度評(píng)價(jià)了MINFLUX顯微鏡。Shechtman說(shuō)：“新的應(yīng)用和方法在不斷開(kāi)發(fā)，但是有兩個(gè)進(jìn)步讓我印象深刻。”一個(gè)就是MINFLUX。“它采用了一種巧妙的方法，來(lái)獲得非常**的分子定位。” 關(guān)于第二個(gè)讓人興奮的進(jìn)展，Shechtman提到了W.E. Moerner及其斯坦福大學(xué)的同事，Moerner也是2014年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的獲獎(jiǎng)?wù)咧弧榱私鉀Q熒光單分子的各向異性散射對(duì)成像分辨率的限制，這些科學(xué)家利用不同的激發(fā)極化來(lái)測(cè)定分子的方向以及位置。另外，他們還開(kāi)發(fā)了精巧的光瞳面。這些技術(shù)改善了結(jié)構(gòu)定位的能力。 關(guān)于熒光標(biāo)記 在許多超分辨率應(yīng)用中，標(biāo)記真的很重要。目前也有一些公司提供相關(guān)產(chǎn)品。例如，德國(guó)美天旎和Stefan Hell創(chuàng)辦的公司Abberior合作，為超分辨率顯微鏡染料提供定制抗體結(jié)合服務(wù)。 其他的一些公司也提供與之相匹配的標(biāo)記。ChromoTek的營(yíng)銷人員Christoph Eckert表示：“我們的Nano-Booster非常小，只有1.5 kDa，而且高度特異。”這些蛋白質(zhì)可與綠色和紅色熒光蛋白（GFP和RFP）相結(jié)合。它們來(lái)源于羊駝抗體片段，被稱為VHH或納米抗體，具有出色的結(jié)合性能，并且質(zhì)量穩(wěn)定，沒(méi)有批間差。這些標(biāo)記適合各種超分辨率技術(shù)，包括SIM、PALM、STORM和STED。 馬里蘭大學(xué)醫(yī)學(xué)院的助理教授Ai-Hui Tang及其同事利用ChromoTek的GFP-Booster以及STORM，來(lái)探索神經(jīng)系統(tǒng)中的信息傳播。他們?cè)谕挥|前和突觸后神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)了分子納米簇，將其稱之為納米柱（nanocolumn）。科學(xué)家認(rèn)為，這種結(jié)構(gòu)表明中樞神經(jīng)系統(tǒng)采用簡(jiǎn)單的原理來(lái)維持和調(diào)節(jié)突觸效率。 各種版本的超分辨率成像以及越來(lái)越多的方法正帶領(lǐng)科學(xué)家更深入地領(lǐng)略生物學(xué)奧秘。在打破了可見(jiàn)光的衍射極限后，生物學(xué)家甚至可以“嚴(yán)密監(jiān)視”細(xì)胞的行動(dòng)。